La purification d’exosomes à partir de culture cellulaire à l’aide de colonnes midi Exo-spin™ et d’affinité membranaire a été réalisée par Dr. Triantafillos Liloglou et Dr. Amelia Acha-Sagredo, Université de Liverpool, Angleterre.
Résumé
Dans le but de réduire les taux de mortalité par cancer du poumon grâce à la compréhension des mécanismes et à l’amélioration du diagnostic précoce, de nombreux travaux de recherche ont récemment été consacrés aux vésicules extracellulaires (EV). L’approche concerne à la fois la biogenèse des EV et le potentiel des biomarqueurs.
L’étude rapportée ici applique deux méthodes d’isolement d’exosomes à un milieu de culture cellulaire à partir de cellules cancéreuses du poumon. Les résultats des échantillons prétraités avec le tampon Exo-spin™ et purifiés à l’aide de colonnes midi Exo-spin™ ont été comparés à l’efficacité de purification d’une méthode basée sur une colonne de centrifugation à affinité membranaire.
Le système de purification Exo-spin™ a été identifié comme étant supérieur à la technique d’affinité membranaire. Ceci a été décrit à travers deux avantages majeurs: 1) les exosomes ne sont pas agrégés; et 2) les exosomes sont prêts à être utilisés sans autre changement de tampon, même dans les applications fonctionnelles en aval. Des analyses sur le nombre de particules et la taille des vésicules ont été réalisées.
Méthodes
Colonnes Midi Exo-Spin™
- 1. Retirer les cellules et les débris cellulaires
- 2. Précipiter les culots contenant les exosomes avec le tampon Exo-spin™ (optionnel)
- 3. Purifier les exosomes à l’aide des colonnes Exo-Spin™ Midi SEC
Affinité de Membrane
- 1. Retirer les cellules et les débris cellulaires
- 2. Mélanger les échantillons avec le tampon de fixation et fixer sur la colonne
- 3. Retirer les particules non fixées par lavage
- 4. Eluer les EV dans le tampon d’élution
Résultats
(A) Comparaison des rendements totaux à partir de 10 mL de milieu de culture cellulaire par la méthode d’isolement des EV. Le rendement total en particules obtenu avec les colonnes Exo-spin™ Midi + Exo-spin™ Buffer est supérieur au rendement obtenu par la méthode d’affinité membranaire. En particulier, le tampon Exo-spin™ est beaucoup plus efficace que le tampon générique PEG 6000 avant la purification des exosomes par la colonne Midi Exo-spin™.
(B) NTA des fractions de EV. Les échantillons d’EV ont été isolés à partir de 10 mL de milieu. (1) La très grande majorité des particules isolées avec la technologie Exo-spin™ se situent dans la plage de 100 à 150 nm, suivant une distribution de taille étroite attendue pour des exosomes très purs et de haute qualité. (2) Les vésicules isolées en utilisant la méthode d’affinité membranaire ont montré une large gamme de particules avec la majorité dans la région 200-400 nm. Les nombres en bleu indiquent les tailles de particules au maximum des pics.
